İMMOBİLİZE GLUKOAMİLAZ İLE

MALTODEKSTRİNDEN GLUKOZ ÜRETiMİ

Yıldız Bozkurt

     Endüstriyel bir enzim olan Glukoamilaz nişastadan glukoz elde etmede kullanılır. Bu çalışmada Aspergillus niger mikroorganizmasından üretilen Glukoamilaz enzimi için yeni bir immobilizasyon metodu geliştirilerek maltodekstrinden glukoz elde edilmiştir. Glukoamilaz ilkönce jelatinleştirilmiş mısır nişastası üzerine adsorblandı. Daha sonra glycerol içerisinde çözülmüş sodyum alginate ile karıştırıldı.  Bir enjektör yardımı ile %1 glutaraldehid içeren %1'lik CaCl2 çözeltisine ilave edilerek fiberler elde edildi. İmmobilizasyon verimi %22 olarak tespit edildi. 20 reaksiyon ve 21 gün boyunca immobilize Glukoamilaz'ın aktivitesinde azalma gözlenmedi.

ENZiM iMMOBiLiZASYONU

            Enzimler hücrelerde biyokimyasal reaksiyonları katalize eden proteinlerdir. Hücrelerde çok önemli metabolik görevleri olan enzimler artık çok çeşitli amaçlar için kullanılmak üzere günlük hayata girmişlerdir. Pekçok endüstriyel, analitik ve klinik proseslerde enzimler substrat çözeltisi ile karıştırılırlar ve ürüne dönüştürüldükten sonra ekonomik olarak geri kazanılamazlar. Enzimlerin sadece bir kere kullanılmaları, pahalı olmaları nedeni ile büyük masraflara neden olmaktadır. Bu nedenle immobilize olarak defalarca kullanılmaları ekonomik olarak daha makul olmakla birlikte enzimatik prosesler sürekli olarak da yapılabilmektedir. Günümüzde çok sayıda immobilize enzim endüstride kullanılmaktadır.

Endüstriyel olarak önemli enzimlerden biri de Glukoamilaz (GA) enzimidir. GA enzimi nişasta ve türevlerinin indirgen olmayan uçlarından a-1,4- ve a-1,6- glikozidik bağlarını hidroliz ederek D-glukozun ayrılması reaksiyonunu katalizler. Bu enzimin en önemli kullanımı  glukoz şurubu (HGS - High Glucose Syrup) ve fruktoz şurubu (HFCS - High Fructose Corn Syrup) üretimidir. Nişasta süspansiyonu asit veya enzim ile karıştırıldıktan sonra Glukoamilaz enzimi ile muamele edilerek nişastadan glukoz elde edilir. Glukoamilaz enzimi çok çeşitli metodlar ile immobilize edilmiştir.      

        Bu metodların  değişik avantaj ve dezavantajları vardır. İmmobilizasyondan sonra enzimin aktivitesi, optimum pH ve sıcaklığı, substrata ilgisi ve stabilitesi değişir. Genellikle enzimin aktivitesi ve substrata ilgisi immobilizasyondan olumsuz etkilenirken, optimum sıcaklığı ve kararlılığı olumlu etkilenir.19,36Enzimdeki bu değişiklikler enzimin yapısına, matriksin tipine ve immobilizasyon şartlarına göre değişir.35      

       Bu yapılan çalışmada Glukoamilaz enzimi uygulanması kolay ve ucuz olan alginate ile immobilize edilmiştir. Normal olarak Ca-alginate ile enzimler immobilize edildiklerinde enzimlerin molekül ağırlığı düşük olduğu için matriksden sızarlar. Enzimlerin alginate ile immobilize edilmeleri için modifikasyonlara ihtiyaç vardır. Enzimin sızmasını önlemek için, mısır nişastasına absorplandıktan sonra alginate fiberlerde immobilize edildi. Fiberlerin dayanıklılığını artırmak için fiberler glutaraldehid ile muamele edildi. Geliştirilen bu yeni metod ile elde edilen immobilize Glukoamilaz enzimi 21 gün ve 20 batch reaksiyon boyunca aktivitesini korumuştur.

      Enzimler endüstriyel amaçlar için büyük miktarlarda üretilmektedir. Enzim immobilizasyonunun başlıca avantajları şunlardır:

¨      Enzimin katalitik gücü kaydadeğer ölçüde stabilize edilmiş olur.

¨      Kolaylıkla tekrar tekrar kullanılabilir.

¨      Ürünler saf olarak kolaylıkla elde edilir.

¨      Sürekli üretim yapılabilir.

¨      Operasyon süresi kısalır.

¨      Üretim maliyeti düşer.

       İmmobilize enzimlerin özellikleri, hem enzim hem de taşıyıcı materyalin özelliklerine bağlıdır. Bu ikisi ile immobilize enzim kimyasal, biyokimyasal, mekanik ve kinetik özellikler kazanır. Şekil 2.1'de de görülen bu özellikler immobilize enzimin verimini ve performansını etkiler.

        İmmobilize enzimin verimi hem bağlanma sırasında olan kayıplardan dolayı hem de enzim moleküllerinin gözeneklerden yavaş yavaş sızması ile azalır. Bu limitler verimi düşürür. Reaksiyon verimini artırmak için yapılabilecek şeyler şunlardır34:

¨      Taşıyıcının partikül boyutlarını düşürmek

¨      Yüksek spesifik aktivitesi olan enzimlerde enzim yükleme miktarını azaltmak

¨      Enzimi taşıyıcı materyalin dış yüzeyine bağlamak

       Pek çok değişik doğal veya sentetik matriksler enzimlerin immobilizasyonunda kullanılmaktadır. Enzimler aşağıda belirtilen metodlarla immobilize edilirler:

 Entrapment

Kovalent bağlanma

Adsorpsiyon

Enzimlerin birbirine bağlanması (Çapraz bağlanma)

        Bu çalışmada Glukoamilaz 'entrapment' metodu ile immobilize edilmiştir. Bu metod ile enzimler jellerin veya polimerlerin içinde tutulurlar. Pek çok çeşitleri vardır. Bunlardan en yaygın olarak kullanılanı ise Ca-Alginate ile immobilizasyondur.

 Ca-Alginate ile İmmobilizasyon

 

       Alginate deniz yosunlarında bulunan bir polisakkarit olup, aralarında (1-4) glukosidik bağları olan b-D-mannuronic (M) asit ve a-L-guluronic asit (G)'ten meydana gelir.28 Şekil 2.2'de alginate'in kimyasal formülü görülmektedir. Endüstriyel olarak üretildiği mikroorganizmalar ise şunlardır:

¨      Laminaria hyperborea

¨      Macrocystis pyrifera

¨      Ascophyllum nodosum

¨      L.digitata, vb.

 

       Alginate molekülünün bileşimi elde edildiği organizmaya ve dokuya göre farklılıklar gösterir. Alginate iki ve üç değerlikli katyonlar ile reaksiyona girerek jel oluşturur. Katyonlar (Ca+2, Sr+2 ,Ba+2, Al+3, Fe+3 gibi) moleküldeki guluronic asitleri birbirlerine bağlayarak jel oluşumuna sebep olurlar.

 

       Jel oluşturma özellikleri alginate molekülünün kompozisyon ve sırasına bağlıdır. G bloklarının uzunluğu jel formasyonunun başlıca yapısal durumunu belirler. Eğer molekülde G miktarı fazla ise sert ve kırılgan bir jel oluşur; eğer M miktarı fazla ise daha yumuşak ve elastik jel oluşumu gözlenir.

     

        Genellikle hücrelerin immobilizasyonunda kullanılan bu metod enzimler için kullanıldığında, bazı özel tekniklerin kullanılması gereklidir. Alginate ile bead, kapsül ve fiber oluşturularak enzim veya hücre immobilize edilebilir.

 Bead ile İmmobilizasyon

       Na-alginate çözeltisine enzim ilave edildikten sonra, bu çözelti 0.2M CaCl₂ çözeltisine damlatılarak ilave edilir. Na-alginate, CaCl₂ ile temas ettiğinde Na-Ca değişimi nedeniyle suda çözünmeyen Ca-alginate bead'leri  meydana gelir ve enzim molekülleri bu bead'lerin içlerinde bulunur. Şekil 2.3'de bead ile immobilizasyon  gösterilmiştir. Zamanla enzim molekülleri bu bead'lerden dışa sızarlar. Bu durumu önlemek için çeşitli metodlar geliştirilmiştir:

 

¨      Oluşturulan bead bir membran ile kaplanabilir.

¨      Enzimlerin molekül ağırlıkları bazı polimerler yardımıyla  artırılabilir. Mesela, dextransucrase, molekül ağırlığının dextran polimerleriyle artırılmasıyla başarılı bir şekilde Ca-alginate içine immobilize edilmiştir.25

¨      Enzimler alginate molekülüne karbodiimid kullanılarak kovalent olarak bağlanabilir. Aspergillus oryzae b-galactosidase, karbodiimide kullanılarak alginate'e kovalent olarak bağlanmış ve daha sonra Ca-alginate bead'lerinde immobilize edilmiştir.7

¨      Kolloidal silika yardımıyla bead'ler sağlamlaştırılabilir.9

¨      Bead'ler kurutularak gözenekler küçültülebilir.

 

Kapsül ile İmmobilizasyon

       Alginate ile iki türlü kapsül oluşturulabilir. Bu metodlardan biri Michigan Proses diğeri ise polylysine yardımı ile kapsül oluşumudur.

 

Alginate-Polylysine Kapsüller

 

       İlkönce hücreler alginate beadleri ile immobilize edilirler. Sonra bead'lerin üzeri poly-L-Lysine ile kaplanarak yarıgeçirgen polisakkarit- polycation (alginate-poly-L-lysine) membran oluşturulur. Sonra bead içerisine 'citrate' verilerek jel halindeki alginate sıvılaştırılır ve kapsül elde edilmiş olur. Şekil 2.4'de polylysine ile kapsül oluşumu gösterilmiştir. Bu metod ile hücreler immobilize edildiklerinde besin ve oksijen gibi küçük moleküller rahatlıkla kapsül içine diffüz ederler, fakat hücre gibi büyük moleküller kapsül dışına çıkamazlar.

 

 

Şekil 2. 4.  Polylysine kullanarak kapsül oluşumu.   

 

 Michigan Üniversitesi Prosesi

 

       Hücre veya enzim CaCl₂ çözeltisi ile karıştırılır. Bir enjektör yardımıyla karıştırılmakta olan Na-alginate çözeltisine enzim-CaCl₂ karışımı damlatılarak kapsüller oluşturulur. Oluşan kapsüller distile su veya uygun tampon çözelti ile yıkandıktan sonra CaCl₂ çözeltisinde bekletilerek sertleşmesi sağlanır. Şekil 2.5'de bu proses gösterilmiştir. Kapsüllerin sağlamlığı açısından şekillerinin düzgün küreler halinde olması gerekir. Bir çalışmada bunu sağlamak için CaCl₂ ve hücre karışımına Xantham gum ilave edilmiştir.5 Kapsüllerin içi sıvıdır ve etrafı alginate membran ile kaplıdır. İç ortam sıvı olduğu için enzimin hareket kabiliyeti bead'lerde olduğu gibi sınırlanmamıştır.

       Bu metod ile üretilen Ca-alginate kapsüllerinin kullanım alanları oldukça geniştir. Reaktör veya fermentörlerde pek çok enzimatik reaksiyon bu metod ile gerçekleştirilebilir; ethanol ve laktik asit üretimi gibi.            

   

Fiber

       Bir miktar Na-alginate glycerol ile karıştırılır. Bu karışıma enzim ilave edilir. Elde edilen karışım bir enjektör yardımı ile %1-2 'lik CaCl₂ çözeltisine iplik halinde enjekte edilir.7 İstendiği taktirde fiberler CaCl₂ ilave edilmeden önce kesilerek kısa şeritler elde edilir. İmmobilize enzim CaCl₂ çözeltisinde yarım saat bekletilir, daha sonra tampon çözelti veya distile su ile yıkanarak kullanılıncaya kadar tampon çözelti içerisinde bekletilir.

 

Teze pdf formatında ulaşmak için tıklayın..